تحولی در Single Cell Sequencing | معرفی روش RAGE-Seq

Single Cell Sequencing

در پست امروز، به مقاله‌ای از Mandeep Singh و همکارانش با عنوان:

High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes

می‌پردازیم. در این مقاله، پژوهشگران به بررسی یکی از چالش‌های اصلی در single cell sequencing پرداخته‌اند. اگرچه این روش از توان عملیاتی بالایی برخوردار است، اما معمولاً تنها خوانش‌های کوتاهی از انتهای cDNA تولید می‌کند و همین موضوع، بازسازی کامل توالی‌های پیچیده‌ای مانند گیرنده‌های آنتی‌ژن را محدود می‌سازد.

معرفی RAGE-Seq

برای حل مشکل بیان شده، Mandeep Singh و همکارانش روش نوینی به نام RAGE-Seq معرفی کرده‌اند که ترکیبی است از

1. توالی‌یابی هدفمند با خوانش طولانی از رونوشت‌های mRNA گیرنده‌های سلول T و B (TCR و BCR)
2. و پروفایلینگ رونوشت‌های کوتاه از کتابخانه‌های سلولی بارکدگذاری‌شده.

این روش نه‌تنها قادر است توالی‌های گیرنده آنتی‌ژن را به‌صورت کامل و با دقت نوکلئوتیدی بازسازی کند، بلکه امکان ردیابی تکامل کلونی سلول‌های B و شناسایی رونوشت‌های با پیوند متناوب را نیز فراهم می‌سازد.

Gene ReArrangement

یکی از عوامل اصلی ایجاد تنوع فنوتیپی سلول‌ها در انسان و سایر مهره‌داران، بازآرایی‌های پیچیده ژنی و رویدادهای پیرایش جایگزین RNA است. بسیاری از این تغییرات با فناوری‌های کنونی توالی‌یابی RNA با خوانش کوتاه به‌خوبی قابل شناسایی نیستند؛ به‌ویژه زمانی که هدف، بررسی بیان mRNA در سطح تک‌سلولی باشد. نمونه‌ای از این چالش، نیاز به روش‌هایی دقیق‌تر برای ردیابی پاسخ ایمنی سلول‌های منفرد در مقابله با سرطان است. هر سلول T یا B تازه‌تمایز یافته، گیرنده‌ای منحصربه‌فرد برای آنتی‌ژن دارد که در نتیجه‌ی بازآرایی‌های پیچیده DNA در ناحیه 5′ از mRNA شکل می‌گیرد و حدود ۴۵۰ نوکلئوتید را تحت تأثیر قرار می‌دهد.

در سلول‌های B، تنوع بیشتر از طریق بازآرایی‌های اضافی DNA برای تغییر ایزوتایپ (Isotype Switching) ایجاد می‌شود. این فرآیند موجب جابه‌جایی میان نواحی ثابت مختلف در انتهای ۳’ زنجیره سنگین mRNA می‌شود که بین ۱۰۰۰ تا ۱۵۰۰ نوکلئوتید طول دارند. افزون بر این، پیرایش جایگزین نیز حدود ۱۰۰ تا ۲۵۰ نوکلئوتید دیگر را در همان ناحیه تغییر می‌دهد و منجر به ترشح آنتی‌بادی‌ها از گیرنده‌های بازآرایی‌شده می‌گردد. پدیده‌های مشابهی از بازآرایی و پیرایش در سلول‌های سرطانی نیز دیده می‌شود. بنابراین، توسعه روش‌هایی که این تغییرات را در سطح تک‌سلولی شناسایی کرده و با داده‌های بیان ژن ادغام کنند، نیازی حیاتی در پژوهش‌های زیست‌پزشکی است.

تنوع TCR و BCR و نوترکیبی V(D)J

تنوع فوق‌العاده‌ی گیرنده‌های آنتی‌ژن بر سطح لنفوسیت‌های B و T، نقش کلیدی در رشد، بقا و فعال‌سازی این سلول‌ها ایفا می‌کند. سلول‌های T، گیرنده‌ای به نام TCR (گیرنده سلول T) را روی سطح خود بیان می‌کنند که یک هترودایمر متشکل از زنجیره‌های α و β یا γ و δ است. این زنجیره‌ها به ترتیب توسط جایگاه‌های ژنی TRA، TRB، TRG و TRD در رده زایا (germline) کد می‌شوند. در مقابل، سلول‌های B گیرنده‌ای به نام BCR (گیرنده سلول B) را به‌صورت یک هتروتترامر روی سطح خود دارند که شامل دو زنجیره سنگین مشابه (کدگذاری‌شده توسط ژن IGH) و دو زنجیره سبک مشابه از نوع کاپا یا لامبدا (کدگذاری‌شده توسط ژن‌های IGK یا IGL) است.

هر یک از این جایگاه‌های ژنی، در پیکربندی اولیه‌ی رده‌زایا، شامل خوشه‌هایی از قطعات ژنی V (متغیر)، D (تنوع) و J (اتصال) هستند. در فرآیندی به نام نوترکیبی V(D)J، یک عضو از هر خوشه به‌صورت غیرقابل برگشت و سوماتیک با هم بازآرایی می‌شوند و یک توالی منحصر‌به‌فرد گیرنده را تشکیل می‌دهند. تنوع بیشتر گیرنده‌ها از طریق افزودن یا حذف تصادفی نوکلئوتیدها در ناحیه‌ی اتصال V(D)J حاصل می‌شود؛ این ناحیه همان CDR3 است که نقش کلیدی در شناسایی آنتی‌ژن دارد. برآورد می‌شود که تنوع گیرنده‌های آنتی‌ژن لنفوسیتی، بیش از 10¹² نوع پروتئین TCR یا BCR را شامل شود.

این سیستم با قانون «هر کلون سلولی، یک توالی گیرنده منحصر‌به‌فرد» کنترل می‌شود؛ بنابراین احتمال این‌که دو لنفوسیت متفاوت گیرنده‌ای کاملاً یکسان داشته باشند، بسیار ناچیز است. زمانی که یک سلول B یا T با یک آنتی‌ژن مواجه شده و وارد فاز تقسیم و گسترش کلونی می‌شود، توالی BCR یا TCR آن به‌عنوان یک بارکد کلونال منحصربه‌فرد عمل می‌کند. این توالی، اطلاعاتی ارزشمند درباره‌ی ویژگی آنتی‌ژن و تبار سلولی در اختیار ما قرار می‌دهد.

ترکیب اطلاعات توالی‌های گیرنده آنتی‌ژن با پروفایل ترانسکریپتومی

توالی‌یابی گیرنده‌های BCR و TCR در سطح سلول منفرد، همراه با پروفایل بیان ژن، دیدگاهی دقیق از پاسخ ایمنی تطبیقی فراهم می‌کند. این بینش در مطالعه‌ی بیماری‌هایی مانند عفونت‌ها، اختلالات خودایمنی و سرطان بسیار ارزشمند است. پیش‌تر نیز در پست «کاربردهای آنالیز multi-omics در بیماری‌های انسانی» به این موضوع اشاره کرده بودیم. یکی از روش‌های رایج برای اتصال توالی‌های جفت‌شده گیرنده آنتی‌ژن با پروفایل ترانسکریپتومی لنفوسیت‌های منفرد، استفاده از scRNA-Seq مبتنی بر روش Smart-Seq2 است.

در این روش، با استفاده از خوانش‌های کوتاه (Illumina)، الگوریتم‌های محاسباتی می‌توانند توالی‌های جفت‌شده TCRα/β یا زنجیره‌های سنگین و سبک ایمونوگلوبولین را بازسازی کنند. با این حال، Smart-Seq2 معمولاً تنها اجازه پردازش ده‌ها تا صدها سلول را می‌دهد. همچنین برای بازسازی گیرنده‌های آنتی‌ژن، به تعداد زیادی خوانش و هزینه‌ی بالا برای هر سلول (حدود ۵۰ تا ۱۰۰ دلار) نیاز دارد. در مقابل، پیشرفت‌های اخیر در scRNA-Seq با توان عملیاتی بالا امکان توالی‌یابی هزاران سلول را با هزینه‌ای بسیار پایین‌تر در مدت زمان کوتاه فراهم کرده‌اند. این فناوری‌ها معمولاً بر ثبت رونوشت‌های mRNA پلی‌آدنیله‌شده، سنتز cDNA، ساخت کتابخانه و توالی‌یابی خوانش کوتاه 3′ با پلتفرم Illumina تکیه دارند.

با این وجود، این روش‌ها یک محدودیت جدی دارند. آن‌ها نمی‌توانند نواحی V(D)J بازآرایی‌شده در انتهای ۵’ رونوشت‌های TCR و BCR را به‌درستی ثبت کنند؛ زیرا تمرکز آن‌ها بر خوانش ناحیه‌ی 3′ است. استفاده از بارکدهای سلولی 5′ در برخی روش‌ها تا حدودی این محدودیت را برطرف کرده است، اما همچنان نمی‌تواند اطلاعات دقیقی از پیرایش جایگزین و سوئیچ ایزوتایپ در انتهای ۳’ ژن IGH استخراج کند. در این زمینه، فناوری‌های خوانش طولانی مانند Oxford Nanopore به عنوان یک راه‌حل بالقوه مطرح شده‌اند، چرا که می‌توانند توالی کامل mRNA را پوشش دهند. البته این فناوری‌ها نیز با چالش‌هایی مانند نرخ خطای بالاتر و عمق کمتر توالی‌یابی نسبت به روش‌های خوانش کوتاه روبه‌رو هستند.

Repertoire and Gene Expression by Sequencing

در این مطالعه، این تیم یک روش جدید و سریع با توان عملیاتی بالا به نام RAGE-Seq (Repertoire and Gene Expression by Sequencing) معرفی کرده‌اند. روش RAGE-Seq یا Repertoire and Gene Expression by Sequencing، یک تکنیک نوین است که توالی‌یابی هدفمند با خوانش طولانی (با استفاده از Oxford Nanopore) را با پروفایل بیان ژن مبتنی بر خوانش کوتاه در سطح تک‌سلولی ترکیب می‌کند.

این روش در فرآیندهای single cell sequencing با توان عملیاتی بالا و مبتنی بر droplet قابل استفاده است. RAGE-Seq می‌تواند پروفایل دقیق بیان ژن (یعنی اطلاعات ژن‌های فعال در هر سلول) را با توالی‌های کامل و هدفمند mRNA، مانند گیرنده‌های آنتی‌ژن BCR و TCR، از هزاران سلول به‌صورت دقیق و مرتبط ارائه دهد. پژوهشگران با استفاده از این روش، توالی‌یابی گیرنده‌های آنتی‌ژن را در هزاران لنفوسیت تومور-مرتبط انسانی انجام دادند. آن‌ها نشان دادند که با مونتاژ de novo خوانش‌های نانوپور، می‌توان توالی کامل گیرنده‌های BCR و TCR را با دقت و حساسیت بالا بازسازی کرد. این شامل شناسایی جهش‌های سوماتیک در زنجیره‌های سنگین و سبک ایمونوگلوبولین نیز می‌شود، که امکان استنباط مسیر تکامل کلونی سلول‌های B را فراهم می‌سازد.

ارزیابی و رفرنس

در یک مطالعه عملی، این تکنیک روی ۷۱۳۸ سلول از تومور اولیه و غدد لنفاوی تخلیه‌شده یک بیمار مبتلا به سرطان پستان اعمال شد. هدف، بررسی تغییرات بیان ژنی و توزیع کلون‌های لنفوسیتی در بافت‌های مختلف بود. نتایج نشان داد که RAGE-Seq ابزاری قدرتمند برای مطالعه تکامل کلونال لنفوسیت‌هاست و در زمینه ایمنی، بیماری‌های خودایمنی و سرطان کاربردهای گسترده‌ای دارد. پیشنهاد میکنیم برای مطالعه این مقاله روی این لینک، و برای دیدن صفحه گیت‌هاب پروژه روی این لینک کلیک کنید.